Microscopia ottica: ingrandimento e microscopio ottico

La microscopia ottica è una tecnica di osservazione capace di produrre immagini ingrandite di oggetti o di particolari di essi, troppo piccoli per essere osservati a occhio nudo. Gli strumenti utilizzati per eseguire tale tecnica prendono il nome di microscopi ottici.

Per vedere un oggetto distintamente è necessario che sulla retina (delicato strato di fibre nervose) dell’occhio umano si formi un’immagine nitida, trasferita attraverso il nervo ottico al cervello da organi fotosensibili quali coni e bastoncelli. Il cristallino (costituito da una capsula contenente una sostanza fibrosa più solida al centro che alla periferia) ha le proprietà di una lente convergente in grado di modificare la sua forma e quindi la sua distanza focale; la sua elasticità consente all’occhio normale di accomodarsi per una visione distinta a tutte le distanze comprese tra d_min = 250 mm (distanza della visione distinta: punto prossimo) e l’infinito (punto remoto). Questa nostra lente convergente infatti non può accomodarsi per distanze inferiori a 250 mm.

La forma apparente di un oggetto è determinata dalla forma della sua immagine retinica, che dipende dall’angolo sotto il quale l’occhio vede l’oggetto. L’apertura angolare del campo visivo di un occhio normale è di circa 140°.

1. Processi ciliari
2. Zonula ciliare
3. Camera posteriore
4. Congiuntiva
5. Pupilla
6. cornea
7. Camera anteriore
8. Iride
9. Cristallino
10. Muscolo ciliare
11. Ora serrata
12. Vena vorticosa
13. Lamina sopracoroidea
14. Coroide
15. Retina
16. Sclera
17. Papilla ottica
18. Arteria e vena centrali della retina
19. Nervo ottico coperto dalle guaine meningee
20. Muscoli estrinseci

Quando si vuole esaminare un piccolo oggetto nei suoi dettagli, lo si avvicina il più possibile agli occhi, affinché l’angolo di osservazione sia il più piccolo possibile e l’immagine retinica la più grande possibile. Ma come detto la minima distanza alla quale l’occhio può adattarsi per una visione distinta è quella del punto prossimo.

Per ovviare a questo “inconveniente” si fa ricorso all’uso di sistemi ottici o sistemi di lenti ed in particolare al microscopio semplice o a quello composto.

Il microscopio semplice è una lente convergente posta tra l’occhio e l’oggetto da osservare in modo che quest’ultimo si trovi in posizione intermedia tra il primo piano focale e la lente stessa (vedi figura seguente). In tali condizioni la lente fornisce un’immagine virtuale dritta e ingrandita dell’oggetto osservabile dall’occhio, posto nel secondo fuoco della lente, anche se si trova ad una distanza dall’oggetto inferiore alla distanza di visione distinta.

L’ingrandimento angolare ottenuto osservando con una lente convergente (d’ingrandimento) un oggetto posto tra il fuoco e la lente stessa, è misurato dal rapporto fra l’angolo visuale sotteso dall’immagine dell’oggetto e l’angolo visuale sotteso dall’oggetto posto alla distanza della visione distinta. Non è possibile parlare di ingrandimento lineare (per le immagini retiniche), dato dal rapporto fra le dimensioni lineari dell’immagine e dell’oggetto, perché il cristallino non è una lente sottile e non gli si possono applicare relazioni semplificate (equazione delle lenti sottili).

L’angolo a sotto cui l’occhio vede l’immagine virtuale dell’oggetto è dato da:

a = h / F

dove h è l’altezza dell’oggetto e F è la lunghezza focale della lente in millimetri. Da considerazioni di carattere trigonometrico, sarebbe il sin a = h / F, ma essendo tali angoli in genere piccoli, si può approssimare il valore del seno dell’angolo al valore dell’angolo misurato in radianti.

L’angolo a’ sotto cui l’occhio vedrebbe lo stesso oggetto, qualora non si facesse uso della lente ed esso fosse disposto alla distanza della visione distinta (d = 250 mm), è dato da:

a’ = h / d

Il rapporto tra tali due angoli da appunto una misura di quanto siano aumentate le corrispondenti immagini retiniche; esso prende il nome di ingrandimento angolare M:

M = a / a’ = h / F / h / d = 250 / F

Dalla relazione risulta che l’ingrandimento angolare di una lente convergente è tanto più grande quanto più piccola è la sua lunghezza focale. Praticamente però, a causa delle aberrazioni (un esempio di aberrazione cromatica è mostrato nella figura a lato) che intervengono, non si possono utilizzare lenti con lunghezza focale inferiore a 20-30 mm. Di conseguenza il massimo ingrandimento angolare ottenibile con una singola lente è di 8-10 volte (8x).

Sostituendo la singola lente con un gruppo di lenti corretto in funzione di limitare al massimo l’effetto delle aberrazioni, si possono raggiungere ingrandimenti che arrivano anche a 40x.

Ingrandimenti maggiori si possono raggiungere invece grazie al microscopio composto, un sistema di due lenti convergenti dette, rispettivamente, obiettivo e oculare. In pratica queste due lenti sono a loro volta costituite da due combinazioni di lenti diverse tali da correggere e ridurre al minimo le aberrazioni, ma, dal punto di vista funzionale, il discorso non muta. L'oggetto da osservare viene posto davanti all'obiettivo (ad una distanza maggiore della sua lunghezza focale), che ne fornisce un'immagine reale, capovolta e ingrandita. Questa immagine viene fatta cadere davanti all'oculare a distanza opportuna, che ne dà un'altra, virtuale, ingrandita e capovolta rispetto all'originale (vedi figura seguente).

Obiettivo ed oculare sono inseriti all'estremità di un tubo metallico (figura a lato) della lunghezza standard di 160 mm, appoggiato su un sostegno detto stativo, il quale regge anche il piatto dove viene posto il preparato da osservare. La distanza tra obiettivo e preparato può essere variata con un movimento a cremagliera del tubo, regolato da due viti, quella macrometrica per spostamenti rapidi e quella micrometrica per la messa a fuoco. Con movimenti laterali del piatto si può esaminare la parte del preparato che interessa di più.

Sotto il piatto si trova il condensatore che fa convergere sull'oggetto la luce prodotta da un’eventuale lampadina incorporata nel microscopio: il condensatore è munito di un diaframma regolabile.

Le caratteristiche fondamentali di un microscopio ottico sono l'ingrandimento, il contrasto ed il potere di risoluzione.

L’ingrandimento visuale complessivo dello strumento, si calcola con criteri analoghi a quelli visti per una singola lente, ed in tal caso è dato dal prodotto dei due ingrandimenti: quello lineare dell’obiettivo per quello angolare dell’oculare. In definitiva avremo:

I = ( l / f₁) (d / f₂)

Dove l = 160 mm coincide con la distanza tra i piani focali più vicini dell’obiettivo e dell’oculare chiamata lunghezza ottica del tubo; d = 250 mm è la distanza di visione distinta (punto prossimo); f₁ e f₂ sono rispettivamente le distanze focali dell’obiettivo e dell’oculare. I rapporti l/f₁ e d/f₂ rappresentano appunto l’ingrandimento, rispettivamente, dell’obiettivo e dell’oculare, i quali portano indicato normalmente il proprio ingrandimento, in modo che si possa facilmente calcolare l'ingrandimento totale per le combinazioni dei diversi obiettivi ed oculari, intercambiabili nei microscopi moderni.

Il contrasto dipende dal diverso assorbimento della luce da parte delle strutture osservate, che risultano così più o meno intense, formando un'immagine. Poiché la maggior parte dei componenti cellulari è trasparente alla luce visibile per l'abbondanza di acqua, non si rivelerebbe quasi nessuna struttura cellulare; si preferisce perciò colorare il preparato con sostanze che si legano in modo selettivo ai componenti delle strutture cellulari, diversificandole.

Il potere di risoluzione è un indice della ricchezza di particolari che si possono osservare nella struttura di un'immagine. Supponiamo che una certa struttura contenga due piccoli punti molto vicini. Se le immagini di questi due punti si sovrappongono non li si vede più come distinti, ma come una struttura unica. Se invece l'immagine li presenta ancora separati possiamo dire che il microscopio ha risolto (separato) questi due punti. La distanza minima alla quale due punti sono visti come distinti si chiama limite di risoluzione. Per il microscopio composto il valore del limite di risoluzione è definito dalla relazione nota come "formula di Abbe" che nella sua espressione più semplificata risulta d = K l (dove: d = potere di risoluzione; K = costante relativa all'obiettivo usato; l = lunghezza d'onda della luce impiegata). Usando luce bianca, cioè quella parte dello spettro elettromagnetico visibile dall'occhio umano, d risulta pari a 0,2 micron; con un aumento del potere risolvente rispetto a quello dell'occhio umano (che si aggira sugli 0,2 mm) di circa 1.000 volte.

Entrando nel dettaglio, si dimostra che la distanza d (limite di risoluzione) è legata alla lunghezza d’onda l della luce usata, all’indice di rifrazione n del mezzo interposto tra oggetto e obiettivo e all’angolo massimo a che un raggio luminoso proveniente dall’oggetto e ancora raccolto dall’obiettivo forma con l’asse ottico di quest’ultimo, dalla formula:

d = ( l l ) / ( 2n sin a)

La quantità n sen a prende il nome di apertura numerica (N.A.) dell’obiettivo. A causa del potere risolutivo finito, un ingrandimento superiore a un certo limite è del tutto illusorio in quanto non guadagna ulteriormente in dettaglio; in pratica non si usano ingrandimenti superiori a 2500x. Allo scopo di migliorare il potere risolutivo, cioè di diminuire d e quindi di poter usare ingrandimenti maggiori, si può agire in tre direzioni. Si può diminuire l , cioè osservare illuminando con luce violetta, che ha appunto la lunghezza d’onda minore della banda di luce visibile. Si può aumentare a, cioè l’apertura dell’obiettivo, e questo richiede una complessa combinazione di lenti per eliminare le aberrazioni in tal caso più evidenti. Si può infine aumentare n interponendo tra oggetto e obiettivo, a contatto con questo, un mezzo di indice di rifrazione maggiore dell’unità: si hanno in questo caso gli obbiettivi a immersione. Il mezzo usato è in genere un olio speciale. Mediante accorgimenti di tale genere si è giunti sino a valori dell’apertura numerica prossimi a 1,60. Il valore di d, facilmente calcolabile supponendo di usare luce normale, è in tal caso di circa 0,15 mm. Mediante il microscopio è possibile mettere a fuoco un sottile spessore del preparato. Tale spessore, detto profondità di fuoco, dipende dall’obiettivo usato ed è generalmente proporzionale al reciproco della radice quadrata dell’apertura numerica. Per N.A. = 1,40 e con luce normale è circa 0,25 mm.