PREMESSA

Scopo delle esperienze di laboratorio che verranno svolte per il settore Microbiologia è quello di dare allo studente un'idea sugli strumenti e

le tecniche di base per lo studio dei microrganismi.
Gli argomenti oggetto dei laboratori sono i seguenti:

1) Modalità di studio e identificazione dei batteri (a cura della dr. Clara Urzì): a) isolamento in coltura pura mediante strisciamento; b) colorazione differenziale di Gram; c) test rapidi di orientamento (KOH, catalasi, ossidasi);  d) saggi biochimici rapidi. 2) Test di sensibilità a composti aventi attività biocida (a cura del dott. Giuseppe Criseo) a) M.I.C. (Concentrazione Minima Inibente); b) antibiogramma

La tassonomia è la scienza della classificazione e consiste di due principali sub discipline, identificazione e nomenclatura.

Il tassonomista cerca di costruire uno schema razionale per classificare e dare un nome agli organismi.

E' importante fare distinzione tra tassonomia batterica e filogenesi batterica. Infatti la tassonomia batterica ha da sempre le sue basi sulla determinazione e lo studio delle caratteristiche fenotipiche, mentre la filogenesi si basa sullo studio delle caratteristiche genotipiche e si è sviluppata dal momento in cui si è cominciato ad applicare le analisi genetiche allo studio dei microrganismi.

I microbiologi devono identificare e classificare i batteri per varie ragioni di carattere pratico.

I microrganismi in base alle loro caratteristiche vengono raggruppati in gruppi artificiali denominati generi. Un dato genere può contenere più specie.

Una specie è di solito definita dalla caratterizzazione di parecchi ceppi o cloni. Per clone si intende una popolazione di cellule geneticamente identiche derivate dalla divisione di una singola cellula.

Gruppi di specie sono raggruppati in generi. Per analogia alla definizione di specie un genere può essere considerato una raccolta di differenti specie ognuna delle quali condivide la maggior parte delle proprietà che caratterizzano il genere, ma che differiscono l'una dall'altra a livello di specie per la presenza o assenza di altre caratteristiche.

Vi sono differenti modi di classificare e raggruppare i batteri. I metodi convenzionali si basano sulla determinazione di una grande varietà di caratteristiche di differenti ceppi o specie.

Le caratteristiche di valore tassonomico che vengono più comunemente utilizzate comprendono: morfologia, caratteristiche tintoriali, classificazione in base alle esigenze nutrizionali (fototrofi, organotrofi, litotrofi), composizione chimica della parete, presenza di inclusioni cellulari e prodotti di riserva, composizione chimica della capsula, pigmenti, richieste nutrizionali (caratteristiche colturali), capacità di utilizzare varie fonti di carbonio, azoto, zolfo, prodotti di fermentazione, richiesta di ossigeno, temperatura di crescita e pH, sensibilità agli antibiotici, patogenicità, relazioni simbiotiche, caratteristiche immunologiche e ecologiche.

Alcune di queste caratteristiche possono essere non necessarie per lo studio di un particolare gruppo e quindi il ricercatore deve di volta in volta giudicare ed estrarre da una gran mole di dati ciò che è necessario per identificare correttamente un dato organismo.

L'identificazione si considera compiuta quando la descrizione della specie tipo è sovrapponibile alle caratteristiche osservate nel microrganismo studiato.

E' vero che alcune caratteristiche si modificano quando i microrganismi sono prelevati dal loro ambiente naturale e coltivati in laboratorio, ma è anche vero che gli schemi di laboratorio sono basati su caratteristiche riscontrate in laboratorio.

Una identificazione in genere si ottiene se si dispone di colture pure o axeniche. Per coltura pura o axenica si intende una popolazione omogenea derivata dalla moltiplicazione di una singola cellula.

Quindi una operazione essenziale e preliminare allo studio dei microrganismi è l'isolamento in coltura pura.
 
 

1. ISOLAMENTO IN COLTURA PURA

Per ottenere colture pure si possono impiegare diverse tecniche: isolamento meccanico di singole cellule mediante micromanipolatore, arricchimento selettivo dell'organismo desiderato o inibizione di quelli non desiderati e successivo piastramento.

1.1. Piastramento per strisciamento e per distensione.

E' uno dei metodi più utilizzati.

Occorrono: un becco Bunsen, un'ansa di platino (o nichelcromo), il materiale da isolare, una piastra contenente un idoneo terreno di crescita per il batterio oggetto di studio.

I metodi sono differenti e ogni laboratorio usa una propria tecnica. In ogni caso è essenziale ottenere alla fine delle colonie ben isolate tra di loro che potranno essere prelevate per i successivi studi che si intendono effettuare.

Procedura:

a) Flambare l'ansa di platino, aprire la piastra contenente le colonie batteriche vicino al Bunsen acceso, lasciare raffreddare l'ansa all'interno del coperchio della piastra, prelevare un frammento della colonia, richiudere la piastra tenendo l'ansa vicino al Bunsen (o in alternativa aprire una provetta contenente la sospensione batterica e prelevarne un'ansata);

b) aprire la piastra contenente il terreno sterile, appoggiare in una zona periferica della superficie ed eseguire degli strisci molto ravvicinati per circa metà della piastra;

c) sterilizzare alla fiamma l'ansa, per uccidere gli eventuali batteri residui, ruotare di circa 90° la piastra, raffreddare l'ansa in una parte non strisciata del terreno agarizzato o nell'acqua di condensa eventualmente presente all'interno del coperchio;

d) appoggiare l'ansa raffreddata su una porzione finale dello striscio precedente e procedere con strisci a zigzag per circa un quarto della piastra;

e) sterilizzare ancora una volta alla fiamma l'ansa, ruotare di circa 90° la piastra, raffreddare l'ansa in una parte non strisciata del terreno agarizzato o nell'acqua di condensa ;

d) appoggiare l'ansa raffreddata su una porzione finale dello striscio precedente e procedere con strisci a zigzag per il restante quarto della piastra (Fig. 1).

Le piastre possono essere allestite per inclusione (a) o per semina superficiale (b).

a) La semina per inclusione può essere allestita inoculando la sospensione batterica e/o le sue successive diluizioni in una serie di tubi contenenti agar fuso e mantenuto a 45° - 50°C, agitato per miscelare bene; l'agar-germi così ottenuto viene versato in piastre Petri sterili e lasciato solidificare. In alternativa, una aliquota della sospensione/diluizione (1 ml) viene inoculata in piastre Petri sterili vuote e successivamente si versa l'agar fuso e mantenuto a 45 - 50°C; si agitano molto bene le piastre con movimenti a Bascuille, per distribuire omogeneamente i batteri e si lascia raffreddare l'agar.

b) La semina può avvenire in superficie su terreno precedentemente versato in piastra e lasciato solidificare, riducendo l'aliquota della sospensione/diluizione, in genere 0.1 ml, da inoculare; si distribuisce in maniera uniforme con una spatola di vetro.

Dopo incubazione delle piastre a T e per un tempo opportuno (in genere, 28° - 37° C per 24 - 48h), se si è proceduto correttamente, si potrà osservare la crescita di colonie ben isolate, da cui si potranno effettuare delle subcolture.

Nella maggior parte dei casi è sempre opportuno effettuare, prima dei successivi studi, un reisolamento per escludere la presenza di cellule batteriche molto ravvicinate che moltiplicandosi abbiano dato luogo ad una fusione della colonia.

1.3. Metodi speciali di isolamento.

Per l'isolamento di alcune specie batteriche si può fare ricorso a tecniche particolari.

a) Isolamento di uno sporigeno. La sospensione mista viene sottoposta a riscaldamento a 85°C per 5 minuti. In tal modo vengono uccise le forme vegetative, mentre le spore essendo resistenti a tale temperatura resistono. Una successiva piastratura darà luogo, se presenti nel campione originario, a colonie di soli sporigeni.

b) Uso di terreni di arricchimento (liquidi). Si utilizzano terreni che contengono composti che facilitano la crescita e la moltiplicazione di una specie particolare, o che sono privi di un composto non necessario per la crescita del microrganismo oggetto di studio. In questo modo si favorisce la crescita della specie microbica desiderata mentre si rallenta quella di altri microrganismi presenti nel materiale polimicrobico. Lo stesso scopo si può ottenere modificando opportunamente i fattori ambientali , quali pH, T, ecc. Il successivo piastramento permetterà più facilmente l'isolamento del ceppo desiderato.

c) Uso di terreni selettivi (solidi) . Si addizionano al terreno composti ad attività batteriostatica o battericida, in modo da inibire o uccidere le specie batteriche non desiderate.

d) Isolamento di una singola cellula. Singole cellule possono essere isolate mediante l'impiego di un micromanipolatore, col quale è possibile manovrare minute pipette capillari mentre si osserva al microscopio.

2. CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE E TINTORIALI

Lo studio microscopico dei batteri può essere effettuato sia con esame a fresco o previa colorazione che serve per aumentare il contrasto durante l'osservazione al Microscopio ottico.

La colorazione permette di determinare più facilmente le dimensioni e la forma delle cellule colorate e di apprezzare alcune strutture cellulari.

I coloranti sono composti organici contenenti dei radicali cromofori che producono colore e dei gruppi auxocromi salificanti.

La maggior parte dei coloranti sono sali, ma vengono chiamati basici se la porzione colorata si comporta come una base, o coloranti acidi se si comporta come un acido.

Prima della colorazione i batteri sono generalmente sospesi in acqua o in altro liquido e distesi su un vetrino ben pulito in modo da formare uno strato sottile e uniforme. Dopo essiccamento all'aria, i microrganismi sono fissati chimicamente o più comunemente al calore, passando rapidamente il vetrino sulla fiamma (Fig. 2).

Le tecniche di colorazione possono essere suddivise in:

Colorazioni semplici - Rendono le cellule meglio evidenziabili all'osservazione microscopica. Richiedono l'uso di un solo colorante (es. blu di metilene, cristal violetto, fucsina basica).

La colorazione semplice è utilizzata per la valutazione della forma, della disposizione e delle dimensioni dei batteri, non consente però di evidenziare i dettagli della struttura interna.

Colorazioni complesse - Richiedono l'uso di più coloranti. Mettono in evidenza non solo la morfologia, ma anche determinate caratteristiche di gruppi di microrganismi (colorazioni differenziali).

Le colorazioni differenziali utilizzano due coloranti, di cui il primo si chiama primario; il differenziamento si ottiene applicando una soluzione che allontana il colorante primario da alcune cellule o strutture; il secondo colorante che colora le cellule decolorate si chiama colorante secondario o di contrasto. Le colorazioni differenziali sono largamente impiegate nell'identificazione dei batteri.

Una delle colorazioni differenziali più comuni è la colorazione di Gram.

E' stata sviluppata nel 1884 dal medico danese Hans Christian Gram allo scopo di distinguere i batteri responsabili delle forme polmonari dai nuclei delle cellule dei tessuti infetti. Egli non fu soddisfatto dal metodo in quanto non tutti i batteri si coloravano. Quello che Gram considerò un difetto costituisce la base della metodica attuale.

Sulla base di questa colorazione, i batteri si possono dividere in due gruppi principali, Gram-positivi e Gram-negativi. In seguito alla colorazione i batteri Gram-positivi si colorano in blu-violetto, mentre i Gram-negativi si colorano in rosso. Il diverso comportamento dei due gruppi di batteri è dovuto alla differente composizione della parete cellulare.

2.1 Colorazione con blu di metilene

E' una colorazione semplice che mette in evidenza la presenza di microrganismi in un materiale.

Materiale occorrente:

Allestimento del preparato come di norma. Aggiungere 1 - 2 gocce della sol. di Blu di metilene e lasciare agire 30 - 60 ", lavare con acqua e osservare al M.O. Le cellule sono colorate in blu.

2.2 Colorazione di Gram

Materiale

Procedura

Sul vetrino opportunamente allestito vengono versate alcune gocce del colorante primario filtrato con carta da filtro per evitare la presenza di cristalli (N.B. l'acido fenico presente nel colorante funge da mordenzante facendolo penetrare meglio all'interno della cellula), si lascia agire per 2-3', si getta l'eccesso di colore e si versa la soluzione di Lugol lasciandola agire per 2-3', si toglie l'eccesso di Lugol e si versare l'alcool assoluto per allontanare il colorante non trattenuto dalle cellule (N.B. la decolorazione è il momento critico della colorazione di Gram perché un trattamento con alcool troppo prolungato potrebbe decolorare anche le cellule Gram +!!!), si lava con acqua di fonte e si copre il preparato con Safranina, lasciandola per 5-8'; si elimina l'eccesso di Safranina, si lava con acqua di fonte e si fa asciugare il vetrino ponendolo in termostato per 10-15'. Si osserva al M.O. Le cellule Gram positive sono colorate in violetto perché hanno trattenuto il colorante primario; le cellule Gram negative sono colorate con il colorante secondario rosso perché sono state decolorate con il trattamento con l'alcool.

Fig. 2. Allestimento di un preparato su vetrino e fasi della colorazione di Gram.

3. TEST PRELIMINARI DI ORIENTAMENTO PER PROCEDERE ALL'IDENTIFICAZIONE

Le prove di seguito riportate sono dei test di rapida esecuzione che non richiedono tempi di incubazione e servono per indirizzare il ricercatore per la scelta delle successive procedure di identificazione.

3.1. Test KOH

E' un metodo alternativo alla colorazione di Gram, suggerito da Ryu nel 1939.

I lipidi presenti nella parete dei Gram negativi vengono disciolti dal trattamento con KOH dando luogo ad una sostanza mucosa; i Gram-positivi, invece, dopo trattamento con KOH non mostrano alcun cambiamento chimico-fisico.

Il metodo è molto semplice e rapido ed ha una buona corrispondenza con la colorazione di Gram (oltre l'80% di coincidenza), non permette però ovviamente la determinazione della morfologia delle cellule batteriche. La relazione tra colorazione di Gram e test KOH non è del 100% risentendo della Gram variabilità di alcuni ceppi e/o dall'età della coltura batterica.

Procedura (Fig. 3):

Su un vetrino portaoggetti viene posta una goccia di KOH al 3% e in essa si stempera un porzione della colonia batterica.

Si agita velocemente con un'ansa e di tanto in tanto si solleva per evidenziare la formazione di un filamento mucoso. Se si forma il filamento la reazione è positiva e i batteri vengono considerati Gram-negativi, se non si forma la reazione è negativa e i batteri vengono considerati Gram-positivi.

3.2. Test della catalasi

Alcuni batteri posseggono l'enzima catalasi, che scinde il perossido di idrogeno (H2O2) in O2 e H2O. Il perossido di idrogeno è comunemente formato per via biochimica durante i processi respiratori per mezzo della riduzione dell'ossigeno con due elettroni mediata dalle flavoproteine. Quasi tutti i microrganismi che crescono aerobicamente producono piccole quantità di perossido. Essi sono però capaci di neutralizzarlo mediante l'intervento della catalasi.

Risposta di alcuni batteri: Bacillus, Micrococcus/Staphylococcus = +; Clostridium, Streptococcus = -.

La prova per mettere in evidenza la presenza della catalasi è descritta dettagliatamente in Figura 4.
 
 

Fig. 4. Metodo per saggiare una coltura microbica per la presenza della catalasi.  Un'ansata abbondante della sospensione cellulare (o frammento di una colonia) è sospesa in una goccia di soluzione al 30% (10 volumi) di acqua ossigenata. La comparsa immediata di bollicine è indicativa della presenza della catalasi. Le bollicine sono prodotte dal'ossigeno prodotto dalla reazione:    2H2O2 ---- 2H2O + O2

 
 

3.3. Test dell'ossidasi

Alcuni batteri posseggono l'enzima citocromo ossidasi, la cui presenza può essere messa in evidenza dalla ossidazione di un accettore artificiale di elettroni la tetra-metil-para-fenilendiammina.

La prova viene eseguita o direttamente sulla colonia cresciuta sulla superficie dell'agar o su della carta da filtro su cui si distende parte della colonia. L'aggiunta di una goccia del reattivo all'1% preparato di fresco (max 24h) darà luogo, in caso di positività, ad una colorazione rosa che tenderà a intensificarsi fino a viola intenso. Se la reazione è negativa non si osserverà nessuna variazione cromatica.

Uso più comune: Permette di distinguere e separare gli enterobatteri (tutti ossidasi negativi) dagli Pseudomonas .
 
 

4. CARATTERISTICHE BIOCHIMICHE

4.1 Le caratteristiche biochimiche coinvolgono numerose proprietà fisiologiche.
 
 

Test	Principio	Procedura	Applicazione principale
Fermentazione dei carboidrati	Produzione di acidi e/o gas durante la crescita per la fermentazione degli zuccheri	Terreno liquido con il carboidrato e un indicatore di pH (es. rosso fenolo), tubi alla Durham, Fig. 5.	Differenziazione di enterobatteri e di parecchi generi o specie appartenenti a altri gruppi
Utilizzazione del citrato	Come unica fonte di C, determina un'alcalinizzazione del terreno	Terreno con aggiunta di citrato e un indicatore di pH (es. blu di bromotimolo) per evidenziare il pH alcalino	Es. per differenziare Klebsiella e Enterobacter da Escherichia o Edwardsiella da Salmonella.
Decarbossilasi (lisina, ornitina, arginina)	La decarbossilazione di aminoacidi libera CO2 e ammine	Terreno arricchito di aminoacidi + indicatore Porpora di bromocresolo che vira a violetto se l'enzima è attivo	Aiuta a determinare il gruppo batterico tra gli enterobatteri
?-galattosidasi (ONPG)	o-nitrofenil-?-galattoside è un substrato artificiale per l'enzima. Quando viene idrolizzato si forma nitrofenolo giallo.	Terreno contenente ONPG, vira a giallo se positivo	Es. per differenziare Citrobacter e Arizona (+) da Salmonella (-). Identificazione di alcune Shigelle e Pseudomonas.
Liquefazione della gelatina	Molti batteri posseggono proteasi e idrolizzano la gelatina	Brodo nutritivo con l'aggiunta di gelatina al 12%. Se la gelatina è idrolizzata il terreno rimane liquido anche dopo raffreddamento.	Aiuta nell'identificazione di diversi generi.
Produzione di H2S	L'H2S viene prodotto in seguito alla degradazione di aminoacidi contenenti gruppi solforici o dalla riduzione del tiosolfato	Terreni ricchi di ferro. La formazione di H2S si evidenzia dalla precipitazione di solfuro ferroso nero	Aiuta nell'identificazione di molti batteri enterici.
Indolo	Il triptofano presente nelle proteine è convertito a indolo	La presenza di indolo è evidenziata dall'aggiunta di reattivi (dimetilaminobenzaldeide)	Permette di differenziare Escherichia (+) da Klebsiella/Enterobacter (-)
Rosso metile	Batteri fermentanti che producono una miscela di acidi sufficiente ad abbassare il pH al di sotto di 4,3.	Terreno glucosato con aggiunta dell'indicatore Rosso metile dopo incubazione.	Differenzia coltura di Escherichia (rosse) da Enterobacter e Klebsiella (gialle).
Riduzione del Nitrato	Il nitrato può fungere da accettore di elettroni (respirazione anaerobia) riducendosi a NO2- o N2	Brodo nutritivo con nitrato. Dopo incubazione la presenza di nitriti è evidenziata dall'aggiunta di ?-naftilammina/acido sulfanilico (colore rosso).	Aiuta la differenziazione di molti batteri enterici (di solito +).
Test di fermentazione/ossidazione (O/F)	Alcuni microrganismi producono acidi solo quando crescono in condizioni di aerobiosi	Produzione di acido sulla parte alta del tubo contenente lo zucchero;	Aiuta a differenziare Micrococcus (solo produzione aerobica degli acidi) da Staphylococcus (produzione di acidi anaerobia). Pseudomonas (produzione aerobica degli acidi) da enterobatteri (produzione di acidi anaerobia).
Fenilalanina deaminasi	La deaminazione produce acido fenilpiruvico che è evidenziato con una reazione colorimetrica	Terreno arricchito in fenilalanina. Dopo la crescita l'aggiunta di cloruro ferrico determina un colore verde.	Caratterizza il genere Proteus e il gruppo Providencia
Idrolisi dell'amido	La soluzione Iodio iodurata dà un colore blu in presenza di amido	I batteri sono fatti crescere in un terreno agarizzato contenente amido. Dopo incubazione si inonda la piastra con liquido di Lugol e si guarda la eventuale zona di chiarificazione intorno alle colonie	Aiuta a identificare batteri capaci di idrolizzare l'amido (ad es. Bacillus).
Ureasi	L'urea (H2N-CO-NH2) viene scissa a 2NH3 + CO2.	Terreno contenente urea al 2% e fenolo come indicatore dell'innalzamento di pH	Permette ad es. di distinguere Klebsiella (+) da Escherichia (-)
Voges-Proskauer (VP)	L'acetoina viene prodotta dalla fermentazione dello zucchero	Aggiunta del reattivo ?-naftolo dopo incubazione; colore rosso se positivo	Discrimina tra Klebsiella e Enterobacter (+) da Escherichia (-). Caratterizza i ceppi di Bacillus.

I test sopra descritti hanno come limitazione soprattutto il tempo occorrente per apprezzare le modificazioni prodotte dai microrganismi. La semplicità e la riproducibilità se accoppiate alla rapidità consentono un ampio uso di questi test.

I sistemi miniaturizzati, forniti da diverse case produttrici (es. Roche, Biomerieux, Minitek, ecc.) hanno il vantaggio di fornire una serie di terreni, in cui si evidenziano differenti attività biochimiche, in un'unica soluzione che possono essere inoculati tutti in una volta e letti in un tempo molto breve (circa 24h).

I risultati ottenuti con i vari sistemi miniaturizzati sono convertiti in profili numerici che consentono di identificare i batteri consultando un apposito elenco in cui sono riportati la maggior parte delle possibili varianti di ogni specie. Ogni casa produce differenti tipi di kit a seconda dei gruppi batterici (e anche lieviti). Ad es. la Biomerieux produttrice dei kit API ha messo in commercio l'API 20E per l'identificazione di Enterobacteriacee, API 20 NE per non-enterobacteriacee, API 20 EC per coliformi, API Strep per streptococcacee, API Staph per Staphylococcacee (Staphylococcus e Micrococcus), API Coryne per corineformi, ecc.

I kit utilizzati nel nostro laboratorio, in base alla caratterizzazione preliminare dei microrganismi oggetto di studio, sono:

API 20 E

API Staph

i cui protocolli di esecuzione vengono dettagliatamente descritti rispettivamente nelle Tav. I-II e Tav. III-VI.

E' ovvio che tali Kit sono stati prodotti e hanno trovato una grande applicazione principalmente nel campo della diagnostica medica.

In ogni caso possono essere utilizzati anche per la messa in evidenza delle caratteristiche biochimiche di batteri ambientali di diversa provenienza.

Una volta in possesso di una descrizione quanto più completa possibile di tutte le caratteristiche di un organismo da identificare, se ne tenterà l'identificazione mediante una chiave adatta, che permetta di confrontarlo con organismi aventi caratteristiche analoghe. La maggior parte delle chiavi sono costituite in modo da presentare una serie di dicotomie. Seguendo le alternative proposte si può arrivare al nome scientifico del microrganismo.

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Colorazione di Gram
Test KOH
Catalasi
Ossidasi

 
 

In base alle prove preliminari, scegliere il kit per l'identificazione rapida dei batteri:
 
 

API Staph
API Coryne
API 20E
API 20EC
API 20NE

Spiegare il motivo della scelta:
 
 
 
 
 
 
 
 

No. codice ottenuto: _ _ _ _ _ _ _

Risultato ottenuto:

Microrganismo: